コーンシルク水抽出物の有効成分であるリグニンが糖化を阻害

Posted On: 10月 22, 2022

植物材料

コーンシルク（ロット：293,011）は児島漢方株式会社より購入。 (大阪、日本)。標本は城西大学薬学部薬学科天然物植物化学研究室に保管された。

抽出

乾燥コーンシルク (500 g) を H を使用して抽出しました。₂O 室温で 24 時間。抽出物を No. 2 定性ろ紙 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan) でろ過しました。残りの水性抽出物をFDU2110（東京理化学機械株式会社、東京、日本）で-83°C、圧力3.1 Paで24時間凍結および凍結乾燥しました。凍結乾燥残渣（１９．７ｇ）が３．９４％の収率で得られた。

限外ろ過

凍結乾燥残渣 (560 mg) を H に溶解しました。₂O (280 mL) を遠心し、Centricon Plus-70 (3 kDa、Merck Millipore Ltd.) を使用して 2000 × で遠心分離します。 g 60分間。得られた分子量＞３ｋＤａおよび＜３ｋＤａの画分の収量は、それぞれ２０８．８ｍｇおよび２８８．８ｍｇであった。

BSA の in vitro 糖化

ウシ血清アルブミン (4 mg/mL) を、抽出物 (25 μg/mL) または画分 (100 μg/mL) の存在下または非存在下で、0.1 リン酸緩衝液 M (pH 7.4) 中、37℃で 7 日間、200 mM グルコースとインキュベートしました。 ℃。インキュベーション後、生成された糖化BSA（CML）のレベルを、鈴木らによって記載された方法に従って糖化BSAに特異的なELISAを使用して測定した。¹⁶. 簡単に説明すると、96 ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを 100 μL の指示されたサンプルでコーティングし、続いて 1 時間インキュベートしました。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（洗浄緩衝液）で３回洗浄した。次に、ウェルをＰＢＳ中の０．０５％ゼラチンで１時間ブロックした。洗浄バッファーで3回洗浄した後、ウェルを100μlの糖化BSAに特異的な抗体（抗AGEsモノクローナル抗体、クローン番号6D12）（Trans Genic Inc.、福岡、日本）とともに1時間インキュベートしました。洗浄バッファーで3回洗浄した後、ウェルをホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合抗マウスIgG抗体（フナコシ株式会社、東京、日本）とインキュベートし、続いて1, 2-フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させました。１．０Ｍ硫酸１００μｌで反応を停止させ、マイクロＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９２ｎｍにおける吸光度を読み取った。阻害は次のように計算されました: 阻害 (%) =[1−(As − Ab)/(Ac − Ab)]× 100、ここで、As はサンプルと共にインキュベートした混合物の糖化 BSA のレベル、Ab はサンプルなしでインキュベートした混合物の糖化 BSA のレベル、およびブランクコントロールとしてグルコースを使用した混合物の糖化 BSA のレベル、Ac はサンプルなしでインキュベートした混合物の糖化 BSA のレベルです。証人としてサンプル。よく知られている合成阻害剤であるアミノグアニジンを、10 mMの濃度で陽性対照として使用しました。

分画の RP-HPLC 分析 > 3 kDa

RP-HPLC テストは、デガッサー、オートサンプラー、カラム、UV 検出器 (検出波長を 254 nm に設定) および蒸発器を備えたポンプで構成される Shimadzu Prominence HPLC システム (Shimadzu Co.、京都、日本) を使用して実行されました。光散乱検出器（ELSD）-LT II（島津製作所）。 ELSD パラメーターは次のように設定されました。ドリフトチューブの温度は 40°C、圧力は 300 kPa です。データは、LabSolutions ソフトウェア (島津製作所) を使用して記録されました。 Senshu Pak ODS カラム (5 μm、内径 250 × 4.6 mm、Senshu Scientific Co., Ltd.、東京、日本) を使用して HPLC テストを実施しました。サンプル濃度は 10 mg/mL でした。注入量、流量、およびカラム温度は、それぞれ 10 μL、1 mL/min、および 40 °C でした。溶媒Aの混合物（H₂O) および B (90% アセトニトリル水溶液) を移動相として使用し、直線勾配システムで溶出しました: 5% 溶媒 B で 3 分間、5 ～ 100% B で 15 分間、100% B で 15 分間サンプルは、HPLC 分析の前に、0.45 µm の Minisart シリンジフィルター (Sartorius Stedim Biotech GmbH、ゲッティンゲン、ドイツ) でろ過しました。

フラクション > 3 kDa の GPC 分析

GPC システムは、SSC-3461 HPLC ポンプ (Senshu Scientific Co., Ltd.)、SSC-2320 カラムオーブン、および ERC-7517 RI 検出器 (IDEX Health & Science、Oak Harbor、WA、USA) で構成されていました。 GPC テストは、TSK-gel Super AW 4000 カラム (150 × 6.0 mm id、Tosoh Co.、東京、日本) を使用して実行されました。移動相は いいえ、 いいえ-ジメチルホルムアミドと 0.5% (3 mol/L) ギ酸アンモニウム溶液。流量は 0.6 mL/min でした。温度は40℃に保った。 Shodex Standard SM-105 (ポリスチレン標準、昭和電工株式会社、東京都港区、日本) を GPC アッセイに使用しました。 GPC データは、μ7 Data Station ソフトウェア (System Instruments Co., Ltd.、八王子、東京、日本) を使用して分析しました。サンプルは５０％水溶液に溶解した。 いいえ、いいえ-10 mg/mL の濃度のジメチルホルムアミド。

分画の NMR スペクトル測定 > 3 kDa

一次元NMRスペクトルは、Agilent 400MR-vnmrs 400分光計（Agilent Technologies、Inc.、Santa Clara、CA、USA; 400 MHzの ¹H、100MHz ¹³C) 溶媒シグナルを内部基準として室温で。すべての化学シフト (δ) は ppm で与えられ、サンプルは D に溶解されました。₂O: アセトン- D₆ (1:1) 100 mg/mL の濃度で。

分画の酸加水分解 > 3 kDa

> 3 kDa (50 mg) の画分を 0.5 NH に溶解しました。₂それで₄ (10 mL) を加え、磁気攪拌しながら 105°C で 5 時間還流した。混合物をアンバーライトＩＲＡ９６ＳＢで中和し、凍結乾燥した。酸加水分解によって生成された糖は、次のセクションで説明するように、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、ラムノース、およびフルクトースの標準マーカーを使用して HPLC によって同定されました。アグリコンを酢酸エチルで抽出し、LC-MS で分析しました。残留物全体を分析のために１ｍＬのＭｅＯＨに溶解した。

糖分分析

糖の HPLC 分析は、Unison UK-Amino カラム (3 μm、250 × 3 mm id、Imtakt Co.、京都、日本) を使用して実行されました。サンプル注入量は 2 μL、流速は 0.6 mL/min、カラム温度は 60°C に維持しました。溶媒Aの混合物（H₂O) および B (アセトニトリル) を移動相として使用し、線形勾配システムで溶出しました: 90% 溶媒 B で 6 分間、90-75% B で 20 分間、75% B で 25 分間。

酸加水分解により放出されたアグリコンのLC-MS分析

LC-MS は、デガッサーを備えたポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン、SPD-40 UV 検出器 (波長 254 nm に固定)、およびLCMS-8050。トリプル四重極質量分析計。データは、LabSolutions ソフトウェア (島津製作所) を使用して記録されました。 HPLC テストは、X Bridge C18 カラム (5 μm、内径 150 × 2.1 mm、Waters Co.、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国) を使用して実行されました。サンプル注入量は 1 μL、流速は 0.2 mL/min、カラム温度は 40°C に維持しました。溶媒Aの混合物（H₂O) および B (アセトニトリル) を移動相として使用し、直線勾配システムで溶出しました: 5% 溶媒 B で 3 分間、5 ～ 20% B で 10 分間、100% B で 33 分間。質量スペクトルは、ESI (ネガティブイオン化スキャンモード) で記録されました。m/z 次の条件を使用して 100 と 600: ネブライザーガス流量、3.0 L/分。乾燥ガス流量、10 L/分。加熱ガス流量、10 L/分。脱溶媒ライン温度、250°C。ブロックヒーター温度、400°C。および界面温度、300°C。バニリン信号 (m/z 151、 [M–H]⁻) が抽出イオンクロマトグラムで確認されました。