ナノボディの製造と三量体化

SARS-CoV-2スパイクタンパク質を標的とするナノボディは、前述のように選択されました^12.13. N 末端標識タンデム ホモ三量体 PelB (MKYLLPTAAAGLLLLLAAQPAMA) 2 結合ナノボディ (GGGGS) の遺伝子₄ リンカーと 6 x C 末端 His タグを合成し、pMES4 ベクターにサブクローニングしました。 正確なアミノ酸配列は次のとおりです。

TP17, MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSSVYNMAWFRQTPGKEREFVAAITGNGGTTLYADSVKGRLTISRGNAKNTVSLQMNVLKPDDTAVYYCAAGGWGKERNYAYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSSVYNMAWFRQTPGKEREFVAAITGNGGTTLYADSVKGRLTISRGNAKNTVSLQMNVLKPDDTAVYYCAAGGWGKERNYAYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSSVYNMAWFRQTPGKEREFVAAITGNGGTTLYADSVKGRLTISRGNAKNTVSLQMNVLKPDDTAVYYCAAGGWGKERNYAYWGQGTQVTVSSHHHHHH;

TP86, MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMAQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSLNIVWFRQAPGKERKFVAAINDRNTAYAESVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCHSADVNGGMDYWGKGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSLNIVWFRQAPGKERKFVAAINDRNTAYAESVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCHSADVNGGMDYWGKGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSLNIVWFRQAPGKERKFVAAINDRNTAYAESVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCHSADVNGGMDYWGKGTQVTVSSHHHHHH.

これらの発現ベクターは、リポ多糖を含まないエレクトロコンピテント BL21 (DE3) に導入されました。 大腸菌 製造元のプロトコル (ClearColi: LGC Ltd.、Middlesex、UK) に従って。 形質転換されたコロニーを採取し、リン酸緩衝ブロスで増殖させた。 とき 大腸菌 培養ブロスは 0.6 AU の OD に達し、最終濃度 1 mM のイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを細胞に添加し、細胞を数時間培養し続けました。 栽培された 大腸菌 遠心分離（2100×g、4 °C で 10 分間)、200 mM Tris (pH 8.0)、0.5 mM EDTA、および 500 mM スクロースを含む TES バッファーで懸濁します。 細胞を 4°C で 1 時間インキュベートした後、50 mM Tris (pH 8.0)、0.125 mM EDTA、および 125 mM スクロースを含む 2 倍量の希釈 TES バッファーを加え、細胞を 4°C で 45 分間インキュベートしました。 、および上清を遠心分離した（20,000×g、4℃で10分間）、回収した。 抽出されたナノボディは、IMAC (Cytiva) を使用して精製され、透析膜で脱塩されました。

細胞株

LentiX-HEK293T 細胞 (Takara Bio #Z2180N) は、10% ウシ胎児血清 (FBS、Sigma-Aldrich #172012) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) を含む DMEM (高グルコース) (Sigma-Aldrich、#6429) で維持されました。 (Sigma-Aldrich、#P4333)。 HOS細胞は、ヒトACE2およびTMPRSS2を安定して発現します（HOS-ACE2-TMPRSS2細胞）は、以前に説明されたように調製されました¹⁵. VeroE6/TMPRSS2 細胞は、SARS-CoV-2 ビリオンの調製のために NIBIOHN の JCRB 細胞バンクから入手しました。

ウイルス様感染性アッセイ

HIV-1ベースのSARS-CoV-2偽型ウイルスは、以前に説明されたように調製されました^12.13. 簡単に説明すると、LentiX-HEK293T 細胞に、全長 C9 タグ付き SARS-CoV-2 スパイク バリアント (D614G、ベータ、ガンマ、デルタ、およびオミクロン) をコードするプラスミドと、レポーター ルシフェラーゼをコードする HIV-1 のトランスファー ベクターをトランスフェクトしました。 PEI MAX トランスフェクション試薬 (Polyscience #24765)。 細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物と共に３７℃で３．５時間、および１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共にさらに４８時間インキュベートした。 次に、上清を回収し、0.45 mm 膜で濾過し、遠心分離しました。 疑似ウイルスは、37 ° C で 1 時間の 4 倍に順次希釈されたナノボディとインキュベートされました.コントロールとして、疑似ウイルスもナノボディなしでインキュベートされました。 次に、ナノボディを含む偽ウイルスと含まない偽ウイルスを HOS-ACE2-TMPRSS2 細胞に添加し、2 日間培養しました。 感染細胞を溶解し、マイクロプレート分光光度計（ARVO X3：パーキンエルマージャパン株式会社、神奈川、日本）を備えたBright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega KK、大阪、日本）を使用してルシフェラーゼ活性を測定しました。 すべてのテストは 3 通および IC で実施されました。₅₀ 値は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して計算されました。 元のデータは補足データにあります。

SARS-CoV-2 ビリオンの調製

東京株（SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokyo）とオミクロン株（hCoV-19/Japan/NC928-2N/2021）は、国立国際医療研究センターから提供されました。 デルタ株 (TKYTK1734) は、東京都衛生研究所から提供されました。 Tokyo株とDelta株にVeroE6/TMPRSS2をMOI 0.1で感染させ、2% FBSを含むDMEMで37℃、1日間培養した。 Omicron 株に VeroE6/TMPRSS2 を MOI 0.1 で感染させ、2% FBS を含む DMEM で 37℃、3 日間培養した。 培地を1500×で遠心分離したg 10 分後、–80°C で保存します。 ウイルス力価を測定するために、培養培地を 2% FBS および PS を含む RPMI1640 で 10 倍に段階希釈しました。 希釈した培地をVeroE6 / TMRPSS2細胞（2×10⁴ 細胞/ウェル）を96ウェルプレートで3〜5日間培養し、各株のウイルス力価をReed-Muench計算法を使用して計算しました。

huACE2トランスジェニックマウスを用いたin vivo感染試験

huACE2 マウスは、生物医学革新、健康、栄養研究所の実験動物リソースバンクから入手しました。 ｈｕＡＣＥ２ヘテロ接合マウスを維持するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとｈｕＡＣＥ２ヘテロ接合マウスを交配させた。 マウスの遺伝子型は、プライマーセット5′-CTTGTGATATGGTGGGGTAGA-3’および5′-CGCTTCATCTCCCACCACTT-3’を使用して、耳のDNAのPCRによって分析されました。 オスとメスの huACE2 マウスは、餌と水を自由に摂取できるプラスチック製のケージで飼育し、25 ± 2°C で 12 時間の明/暗サイクルで飼育しました。 HuACE2 Tg マウスを無作為に 2 つのグループに割り当てました (PBS 処理 (いいえ= 6) および TP17/86 カクテルケア (いいえ= 6)) TP17/86 カクテルの保護効果を評価します。 huACE2 Tg マウスを、麻酔下で耳鏡と挿管プラットフォームを使用して挿管チューブ (22G 32 mm、KN-1008-2、夏目製作所) に挿入しました (100 μl/マウス、メデトミジン: 20 μg/ml、ミダゾラム: 600 μg/ ml、ブトルファノール: 1 mg/ml) その後、気道から SARS-CoV-2 ウイルス (祖先およびデルタ、1 × 10 の用量で) に感染⁴ TCID₅₀ 25μlで。 1×10 の線量のオミクロン⁵ TCID₅₀ 25μlで）100μlのマイクロピペットを使用して。 感染したマウスは、アチパメゾール（１００μｌ／マウス、２０μｇ／ｍｌ）の腹腔内注射を受けた。 感染の 1 日後、感染したマウスは、感染が行われた方法と同様に、1.2 mg/kg の TP17/86 カクテル (VHH) または PBS (コントロール) を気管内投与されました。 感染したマウスの体重と生存率は、最大 14 日間毎日監視されました。 明らかにやせ衰えたマウスは、体重を記録した後に安楽死させ、死亡したとみなした。 元のデータは補足データにあります。

倫理声明

すべてのマウス実験は、日本学術会議の動物実験の適切な実施に関するガイドラインに従って行われました。 プロトコルは NIBIOHN Institutional Animal Care and Use Committee (承認 ID: DSR02-24R3) によって承認されました。 SARS-CoV-2 に感染した huACE2 Tg マウスを使用したすべての実験は、BSL3 施設の承認された標準操作手順に従って、NIBIOHN のつくば霊長類研究センターの改良された BSL3 封じ込め実験室で行われました。

ウイルス RNA の精製と RT-qPCR

HuACE2 Tg マウスを無作為に 2 つのグループに割り当てました (PBS 処理 (いいえ = 5) および TP17/86 カクテルケア ( いいえ= 5)) SARS-CoV-2 のウイルス量を評価する。 ウイルス感染および TP17/86 カクテルの投与は、上記のように実行されました。 肺における SARS-CoV-2 Tokyo 株のウイルス量を測定するために、gentleMACS を使用して 3 ml の PBS で臓器をホモジナイズしました。^MT Dissociator および M チューブ (Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ)。 製造業者のプロトコルに従って、ＴＲＩｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）によって２５０μｌの肺ライセートを使用して、肺ＲＮＡを精製した。 逆転写酵素（RT）反応は、500 ngの肺RNAを使用して、gDNAリムーバー（TOYOBO、大阪、日本）を含むReverTra Ace qPCR RTマスターミックスで実行されました。 SARS-CoV-2 サブゲノム RNA を定量化するために、RT 反応生成物を 1/10 で希釈し、5 μl の希釈液を、TH​​UNDERBIRD Probe qPCR Mix (TOYOBO) および以下のプライマー/プローブ セットを使用した定量的リアルタイム PCR にかけました。 ; 5′-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3′ (フォワードプライマー)、5′-ATATTGCAGCAGTTACGCACACA-3′ (リバースプライマー)、および FAM-5′-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3′-BHQ1 (プローブ)。 qPCR 条件は、95°C で 5 分間、95°C で 15 秒、続いて 60°C で 60 秒の 45 サイクルでした。 サブゲノム RNA コピー数を調べるために、RT-qPCR と同じプライマー セットで増幅された PCR フラグメントを pMD ベクターにクローニングし、RT-qPCR 標準に使用しました。 肺のサブゲノム RNA コピーの数を定量化するには ( そこの)、RT-PCR によって得られたコピー数 (a) は次のように計算されました。

元のデータは補足データにあります。

統計分析

統計分析は、GraphPad Prism 7.0f (GraphPad Software、La Jolla、CA、USA) によって実行されました。 二尾の学生あなたテストは体重とサブゲノム RNA の RT-qPCR に使用され、ログラング テストは生存率に使用されました。p<0.05 は統計的に有意であると見なされました。

レポートの概要

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature ポートフォリオ レポートの概要をご覧ください。