β-グルカン産生オーレオバシジウム・プルランスN-163株を経口摂取した後のジストロフィーmdxマウスの線維症の解消

Posted On: 10月 9, 2023

この研究は、動物研究ガイドライン「生体内実験の報告」に従って実施されました。 C57BL/10SnSlc マウス (3 週齢、雄) を日本 SLC, Inc. (日本) から入手しました。 C57BL/10-mdx/Jcl マウス (3 週齢、雄) を日本クレア (日本) から入手しました。この研究で使用した動物はすべて、動物の愛護及び管理法（昭和48年10月1日環境省法律第105号）、実験動物の飼養管理基準及び鎮痛基準に従って飼養された。（平成18年4月28日環境省意見第88号）及び動物実験の適正な実施に関する指針（平成18年6月1日日本学術会議）。

研究会

グループ 1: 通常

15匹のC57BL/10SnSlcマウスは屠殺されるまで何の治療も受けなかった。

グループ 2: 車両

15匹のmdxマウスにビヒクルを経口投与した [pure water] 0 日目から 45 日目まで 1 日 1 回、10 mL/kg の量で投与します。

グループ 3: N-163 β-グルカン

15匹のmdxマウスに、N-163株を補充したビヒクルを経口投与し、0日目から45日目まで1日1回、APIとして3 mg/kgの用量、10 ml/kgの容量でβ-グルカンを産生した。

β-グルカン生産株 N-163 (Neu-REFIX™) は、株式会社ジーエヌコーポレーションより提供されました。 N-163 β-グルカンを必要量のRO水と混合し、完全に溶解するまで撹拌しました。溶液を 7 本のチューブに分注し、投与当日まで 4 °C で保存しました。投薬製剤は投与前に振盪した。投与製剤は7日以内に投与された。

ビヒクルおよびN-163 β-グルカンを10 mL/kgの量で経口投与した。
N-163 β-グルカンを 3 mg/kg API の用量で 1 日 1 回投与しました。

動物は、温度 (23 ± 3 °C)、湿度 (50 ± 20%)、照明 (12 時間の人工明暗サイクル、午前 8 時から午後 8 時までの照明) の制御された条件下で SPF 施設内で維持されました。。そして空気の入れ替え。動物はTPXケージ(日本CLEA)に収容し、1ケージあたり最大5匹のマウスを飼育した。

寝具は滅菌紙（日本SLC）を使用し、1週間に1回交換した。通常の滅菌飼料を自由に与え、ケージ上の金属カバーの中に置いた。 RO水は、ゴム栓と吸引チューブを備えた水ボトルから自由に供給されました。水ボトルは週に 1 回交換され、洗浄され、オートクレーブで滅菌されて再利用されました。マウスは耳パンチを使用して識別されました。各ケージには特定の識別コードが付けられました。治療開始の前日に、mdx モデルマウスを体重に基づいて 15 匹ずつ 2 つのグループに無作為に割り当てました。無作為化は、Excel ソフトウェアを使用して体重によって階層化された無作為サンプリングによって実行されました。 mdx モデルマウスは、SD を取得するために体重によって階層化され、グループ間の平均体重の差は可能な限り小さくなりました。

生存率、臨床徴候 (嗜眠、筋肉のけいれん、呼吸困難)、および行動を毎日監視しました。治療前に体重を毎日記録した。マウスは、投与前後に毒性、罹患率、死亡率の重大な臨床徴候がないか観察された。４５日目に、イソフルラン麻酔下（ファイザー社）下で腹部大静脈からの放血により動物を屠殺した。

研究の終わりに、尿サンプルが収集され（>50 μL）、生化学のために-80 °Cで保存されました。研究の最後に、事前に冷却した注射器を使用して、非空腹時血液を腹部大静脈から採取しました。採取した血液を、抗凝固剤 (ノボヘパリン) を含む予冷したポリプロピレンチューブに移し、遠心分離するまで氷上で保存しました。血液サンプルを 4℃、1,000 × g で 15 分間遠心分離しました。上清を収集し、生化学のために -80 °C で保存しました。

屠殺後、大腿四頭筋、腓腹筋、ヒラメ筋、足底筋、前脛骨筋、長趾伸筋、横隔膜、および心筋の筋肉を採取した。個々の筋肉の重量を測定しました。以下に説明するように、各筋肉を分離、解剖し、保管しました。

1.

トラガカントはコルクディスク上に配置され、配向された筋肉のベースを提供するのに十分な量のトラガカントが配置されました。
2.

トラガカントの一端は、筋肉の長軸がコルクディスクに対して垂直になるように配置されました。
3.

サンプルを急速冷凍し、液体窒素で冷却したイソペンタン中に入れました。
4.

凍結したブロックをドライアイスに移し、イソペンタンを約 1 時間蒸発させました。
5.

凍結ブロックは-80℃で保管した。

血漿生化学の測定

すべてのマウスに

ALT、AST、LDHの血漿中濃度は富士ドライケム7000（富士フイルム株式会社）により測定した。

サブグループ用 A (各グループから n = 5)

シスタチン C および TGF-β の血漿レベルは、市販の酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) キットを使用して測定しました。

サブグループ用 B (各グループから n = 5)

IL-13およびハプトグロビンの血漿レベルは、市販のELISAキットを使用して測定されました。

尿生化学の測定

すべてのマウスに

尿中のミオグロビンおよびタイチンのレベルは、市販の ELISA キットを使用して測定されました。

ELISA キットを補足表 1 に示します。

組織学的分析

ロータリーミクロトーム（Leica Microsystems）を使用して、筋肉組織のパラフィンブロック（TBD）から切片を切り出しました。切断後、各スライドをブラインド評価用の番号としてコード化しました。各数値は Excel ソフトウェアの RAND 関数を使用して生成され、昇順に並べ替えられ、スライドに割り当てられました。組織スライドは染色に使用され、実験者によって評価されました。

HE 染色では、筋肉組織 (前脛骨筋) の凍結ブロックから切片を切り出し、リリーマイヤーヘマトキシリン (武藤純薬株式会社、日本) およびエオシン溶液 (富士フイルム和光純薬株式会社) で染色しました。炎症スコアは、Tinsley 基準に従って計算されました。⁹以下に示すように:

炎症スコア

0 = なし～最小限: 筋束または筋束間の結合組織に炎症がない。時折、単核炎症細胞が存在する場合がありますが、明らかな凝集はありません。

1 = 軽度: 単核炎症細胞の局所的な凝集を伴う束間結合組織に時折単核炎症細胞が存在する。

2 = 中等度:束間結合組織における単核炎症性細胞の浸潤の複数の病巣。個々の筋線維の間に時折単核炎症細胞が存在します。

3 = 重度：束間結合組織内の単核炎症細胞の浸潤の大きな病巣がいくつかあり、束間および束内の空間が拡大して束内結合組織に広がっています。

マッソントリクローム染色では、凍結筋肉切片（横隔膜、7 匹のマウス/グループ）をワイゲルト鉄ヘマトキシリン作業溶液（Sigma-Aldrich）、ビーブリッヒのスカーレット酸フクシン溶液（Sigma-Aldrich）、リンタングステン/リンモリブデン酸溶液、アニリンブルーで染色しました。。溶液および 1% 酢酸溶液 (Sigma-Aldrich)。

線維化領域の定量分析のために、デジタルカメラ (DFC295; Leica、ドイツ) を使用して、マッソントリクローム染色切片の明視野画像を倍率 200 倍で撮影し、切片あたり 5 つの視野 (未定) の陽性領域を測定しました。 ImageJ ソフトウェア (米国国立衛生研究所)。

統計的検定

統計分析は、Prism 6 ソフトウェア (GraphPad ソフトウェア、米国) を使用して実行されました。統計分析は、ボンフェローニ多重比較検定を使用して実行されました。以下のグループ間で比較を行った：（１）グループ２（ビヒクル）対グループ１（標準）およびグループ３（Ｎ－１６３ β－グルカン）。統計的有意性は次のように設定されました。 P<0.05。結果は平均値 ± SD として表されます。片側 t 検定が返されたときに傾向またはトレンドが想定されました P-値 < 0.1。以下のグループ間で比較を行った。

1.

グループ 2 (車両) vs グループ 1 (通常)
2.

グループ 2 (ビヒクル) vs グループ 3 (N-163 β-グルカン)

倫理承認

プロトコルの承認は、日本の IACUC である SMC Laboratories から取得しました (研究プロトコル番号: SP_SLMA143-2208-3)。この研究は、動物研究ガイドライン「生体内実験の報告」に従って実施されました。 C57BL/10SnSlc マウス (3 週齢、雄) を日本 SLC, Inc. (日本) から入手しました。 C57BL/10-mdx/Jcl マウス (3 週齢、雄) を日本クレア (日本) から入手しました。この研究で使用したすべての動物は、次のガイドラインに従って飼育されました：動物の愛護及び管理法（環境省、昭和48年10月1日法律第105号）、飼養及び実験動物の管理及び鎮痛に関する基準。（平成18年4月28日環境省意見第88号）及び動物実験の適正な実施に関する指針（平成18年6月1日日本学術会議）。