ANGPTL3 ワクチンの生涯反復投与のマウスにおける有効性と安全性

Posted On: 11月 1, 2023

ワクチンの設計と合成

我々は、LPL 阻害ドメインの領域 (32-41 aa) に対応する候補ペプチド E3 を設計しました。⁵。合成後、各ペプチドの N 末端を KLH に結合し、合成ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で精製しました (純度 > 98%) (ペプチド研究所、大阪、日本)。免疫化の前に、ペプチド溶液を等量の完全/不完全フロイントアジュバント（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）と混合した。

動物実験とワクチン接種

倫理委員会は熊本大学医科学部動物実験計画書に基づき動物実験を承認した。生後 8 週齢の野生型 C57BL/6 J 雄マウスを Charles River Laboratories (横浜、日本) から購入し、24℃、12 時間の明暗サイクル下、通常の餌と水を自由に摂取させて飼育しました。。。屠殺される１０分前に、雄マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇのメデトミジン、４．０ｍｇ／ｋｇのミダゾラム、および５．０ｍｇ／ｋｇのブトルファノールの組み合わせを腹腔内注射により投与して麻酔をかけた。その後、尾から血液を採取した。この後、マウスは頸椎脱臼により人道的に安楽死させられ、臓器が採取されました。

ANGPTL3ワクチンの持続性の評価

8 週齢の雄 C57BL/6 J 野生型マウス (ない = 11) は、100 μg の KLH 結合 E3 ペプチドの皮内注射を受け、続いて 2 週間および 4 週間後に同様の免疫を行いました。対照には、同じプロトコールに従ってフロイントアジュバント中のKLHを注射した。ワクチンの耐久性を評価するために、最初のワクチン接種から 6、20、30、60、62、90、92 週間後に、絶食していないマウスの血液サンプルを尾静脈から採取し、抗体の力価と非免疫力価を調べました。空腹時のTGレベル。を以下のように評価した。

免疫マウスにおける抗ANGPTL3抗体力価の評価

抗体力価は記載どおりに評価されました⁴。簡単に説明すると、ELISA プレート (MaxiSorp Nunc; Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州) を炭酸緩衝液中の 5 mg/mL の ANGPTL3 候補ペプチドで 4℃ で一晩コーティングしました。ペプチドはキャリアタンパク質 BSA (Peptide Institute) に結合されました。 5% スキムミルクを含む PBS でブロッキングした後、血清をブロッキング緩衝液で 100 ～ 312,500 倍に希釈しました。 4℃で一晩インキュベートし、その後洗浄した後、プレートをマウスIgGに特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合抗体（GE Healthcare、シカゴ、イリノイ州）とともに周囲温度で3時間インキュベートしました。 PBSで洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質3,3′-5,5′-テトラメチルベンジジン(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)を使用して発色させ、反応を酸性硫酸0.5Nで停止させた。 450 nmでの波長をマイクロプレートリーダー(iMark、Bio-Rad、Hercules、California)でモニタリングした。最大半分の抗体力価は、希釈範囲内の各サンプルの最高値に基づいて決定されました。

血液化学

非絶食および絶食条件下での血中TGレベルは、LabAssayキット（富士フイルム和光純薬株式会社）を使用して、製造業者のプロトコールに従って測定した。屠殺時のALT、AST、尿素窒素（UN）、およびクレアチニンの血中濃度はSRL（東京、日本）によって測定され、空腹時脂質プロファイル測定はLipoSEARCH（免疫生物学研究所）（群馬、日本）によって実行されました。。

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応解析

メーカーのプロトコールに従って、TRIzol試薬(Thermo Fisher Scientific)を使用して全RNAを抽出しました。簡単に説明すると、DNase 処理した RNA を Prime Script RT 試薬キット (タカラバイオ株式会社、滋賀県、日本) を使用して逆転写しました。 SYBR Premix Ex TaqII（タカラバイオ株式会社）を用いて定量的リアルタイムPCRを行った。転写物の相対的な存在量は、マウスの 18S rRNA レベルの相対存在量に対して正規化されました。プライマー配列を補足表 1に示します。

組織学的分析

パラフィン包埋肝臓組織を 4 μm の切片に切断し、ヘマトキシリン-エオシンまたはアザン-マロリー染色に供しました。線維化の程度は、アザン・マロリー染色切片の規定領域における青色陽性の割合（％）に基づいて計算した。すべての画像解析は Photoshop 2022 (バージョン 23.5.5) (Adobe Inc.、カリフォルニア州サンノゼ) を使用して実行されました。

統計分析

連続変数の分布の正規性は、コルモゴロフ-スミルノフ検定によって評価されました。分布が正規の場合、データは平均値 ± SEM として表されました。 2 つのグループ間の比較は、Student 法を使用して行われました。 t テスト。分布が正規でない場合、データは中央値±四分位範囲 (IQR) として表され、マン-ホイットニー法を使用して 2 つのグループ間の比較が行われました。 Uテスト。週効果、ワクチン効果、およびそれら 2 つの相互作用を説明変数として使用して、混合効果モデルを反復測定データに適用しました。このモデルでは、個々のマウスの識別はランダムな切片として定義されました。相互作用の統計的有意性を評価するために、尤度比検定を実行しました。 p<0.05 は統計的に有意であると考えられました。分析は、GraphPad PRISM バージョン 9.5.1 (GraphPad Software, Inc.、カリフォルニア州ラホーヤ) および STATA MP 17.0 ソフトウェア (StataCorp.、テキサス州カレッジステーション) を使用して実行されました。