SARS-CoV-2 に対する塩化セチルピリジニウムうがい薬の抗ウイルス効果

Posted On: 8月 18, 2022

細胞培養

Vero E6 細胞 (ATCC、マナッサス、バージニア州、米国) は、10% ウシ胎児血清 (FBS) (v/v) を添加したダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) で維持し、37°C、5% CO2 でインキュベートしました。 Vero E6 安定発現ヒト TMPRSS2 細胞 (VeroE6/TMPRSS2)³² もこの研究に使用されました。

ウイルス

SARS-CoV-2 武漢 (WK-521; EPI_ISL_408667)、アルファ (QK002; EPI_ISL_768526)、ベータ (TY8-612; EPI_ISL_1123289) およびガンマ (TY7-501; EPI_ISL_833366) 株は、西城博士 (国立研究所) から提供されました。感染症学、東京、日本）。これらのウイルスは、VeroE6/TMPRSS2 細胞を使用して調製されました。 SARS-CoV-2 を使用したすべての実験は、北海道大学国際人獣共通感染症研究所レベル 3 (BSL-3) 施設 (承認番号: 19(19)、#21002-3 ) で実施され、標準操作手順に従っています。 BSL-3。なお、病原体を用いた実験計画はすべて北海道大学大学院歯学研究科の承認を受けています（承認番号：R-2-4-1）。

試薬

CPC (TCI、東京、日本) を蒸留脱イオン水 (DDW) で溶解し、フィルター (直径 0.45 μm) (Sartorius、ゲッティンゲン、ドイツ) で滅菌しました。さらに、界面活性剤であるTriton X-100（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）を陽性対照として使用しました。陰性対照としてPBSを使用した。

健康なボランティアの唾液

唾液は、5 人の健康で予防接種を受けていないボランティアによって提供されました。すべての唾液サンプルは、実験前に定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) によって SARS-CoV-2 に対して陰性であると判断され、1 つのチューブで混合されました。この実験は、北海道大学の施設倫理委員会によって、ヒト由来の材料を使用することが承認されています。唾液を採取する前に、各ボランティアからインフォームドコンセントを得た (承認番号: 2021-2)。

細胞生存試験

VeroE6/TMPRSS2 の細胞生存率は、MTS によって測定されました。 [3-(4,5-dimethylthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega、マディソン、ウィスコンシン州、米国) を使用して、さまざまな濃度の CPC (0 ～ 50 μg/mL) の存在下で 37°C で 1 時間テストします。ＧｌｏＭａｘＭｕｌｔｉｐｌｕｓＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ／Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で吸光度を測定した。 3回の独立した実験を3回行った。

プレートテスト

SARS-CoV-2 株を等量の CPC 溶液 (最終濃度: 2% FBS を含む DMEM で 0 ～ 50 μg/mL) または SP-T 医療用うがい薬 (ライオン株式会社、東京、日本) と混合し、希釈したCPC と同様に、PBS で 50 μg/mL の濃度にします。混合物を室温で３０分間インキュベートし、２％ＦＢＳＤＭＥＭで１／１０に希釈して、混合物中のＣＰＣを低下させた。希釈混合物をVeroE6/TMPRSS2細胞に接種し、回転させながら37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を 1 × PBS で 2 回洗浄して CPC を除去し、1.2% Bacto Agar (Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、USA) を含む 2% FBS DMEM で覆った。 37℃で48時間培養した後、細胞を3.7%緩衝ホルムアルデヒドで一晩固定した。固定された細胞は、1% クリスタルバイオレットで染色されました。 SARS-CoV-2 に感染した細胞は細胞変性効果を示し、感染細胞の塊はプラークなどの染色されていない領域として見ることができます。

ウイルス侵入テスト

VeroE6 / TMPRSS2細胞を24ウェルプレートに1.0×10 密度で播種しました⁵ セル/ウェル。 SARS-CoV-2 武漢株を同量の CPC と混合しました (最終濃度: 0 ～ 25 μg/mL)。各薬物濃度で、ウェルに 1.0 × 10 を感染させました。³ ウイルスの PFU (MOI = 0.01)。混合物を室温で30分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物をVeroE6/TMPRSS2細胞に接種し、回転させながら37℃で1時間インキュベートした。 1時間の取り込み後、細胞を1×PBSで2回洗浄してCPCを除去し、維持培地で培養しました。感染後 24 時間 (hpi) に、TRIzol™ 試薬 (Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) を使用して接種細胞から全 RNA を抽出し、RNeasy Mini キット (QIAGEN、ヒルデン、ドイツ) を使用して全 RNA を抽出しました。抽出された RNA は、THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR Kit (TOYOBO、大阪、日本) を使用して qRT-PCR 分析にかけられました。 SARS-CoV-2 ゲノムは、N2 のプライマープローブセット (宝、滋賀、日本) を使用して定量化されました。非ヒト霊長類β-アクチンを内因性コントロールとして使用しました。非ヒト霊長類β-アクチンのプライマーおよびプローブ配列は以前に記載されています³³. SARS-CoV-2 N 遺伝子レベルは、β-アクチン mRNA のレベルで正規化されました³⁴. さらに、24 hpi でのウイルス RNA レベルは、0 hpi でのウイルス RNA レベルで正規化されました。すべての RT-PCR アッセイは、CFX96 Real-Time PCR System (BioRad、Hercules、CA、USA) を使用して実行されました。 3回の独立した実験を3回行った。

唾液中のSARS-CoV-2に対するCPCの殺ウイルス活性の分析

健康なボランティアから採取した唾液に SARS-CoV-2 武漢株を添加し、等量の CPC と混合しました (最終濃度: 0 ～ 40 μg/mL)。唾液混合物を 1:100 に希釈して粘度を下げ、0.45 μm フィルター (Sartorius) でろ過して細菌と真菌を除去しました。プラーク試験は、前述のように実行されました（「プラーク試験」セクション）。 3回の独立した実験を3回行った。

ショ糖密度勾配分析

SARS-CoV-2 武漢株は、室温で 10 分間、CPC (50 μg/mL) または Triton X-100 (1%) で処理されました。インキュベーション後、混合物を 10% から 50% のスクロース密度勾配にロードしました。 Optima XE-90 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) で 250,000 × 6 時間の超遠心分離後g、100 μL の各勾配を 22 画分に分割し、100 μL の SDS-PAGE サンプルバッファーと混合し、95°C で 5 分間煮沸しました。煮沸後、それらを 10% SDS-PAGE で分析した後、抗 SARS-CoV-2 S タンパク質モノクローナル抗体 (GTX632604) または N タンパク質ポリクローナル抗体 (GTX135357) を使用した免疫ブロッティング分析を行いました. ウサギ (GeneTex, Irvine, CA) から、米国）。転写後、メンブレンを１００ｋＤａで切断し、プロテインＳ抗体およびプロテインＮ抗体とそれぞれハイブリダイズさせ、可視化した。 ImageQuant LAS 4000 mini（FUJIFILM Corporation、東京、日本）をイメージングに使用しました（図S4）。

透過電子顕微鏡法

SARS-CoV-2 武漢株を 1 × PBS、CPC (10、50、および 250 μg/mL)、および Triton X-100 (1%) で室温で 10 分間処理しました。混合物を２．５％グルタルアルデヒドで４℃で２４時間固定した。固定したサンプル (5 μL) をパラフィルムのシートに置きました。 Formvar Film (#10-1009、応建商事、東京、日本) を各ドロップに置き、5 分間ウイルスを吸着させました。グリッドを DDW で洗浄し、濾過した 2.0% 酢酸ウラニル溶液の滴の上にさらに 1 分間置き、風乾し、JEM-1400 TEM (JEOL、東京、日本) を使用して 80 kV で調べた。

統計学

統計分析は、Graphpad Prism v9 (GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。データは、生物学的トリプリケートの平均 ± SD 値として表示されます。統計分析は、一元配置分散分析を使用して実行されました。すべてのデータセットについて、 p 0.05 未満の値は有意と見なされました。