福島県の小児甲状腺がんでは、電離放射線被ばくの指標である転座染色体異常は増加していない

Posted On: 8月 31, 2023

倫理声明

本研究における検体および診療記録の使用については、福島県立医科大学医学部倫理委員会の承認を得た（承認番号2654）。 PB サンプルの分析については、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られ、プロトコルは国際医学機関評議会の承認されたガイドラインに従って実行されました。³⁶。

トピック

東日本大震災当時、FP に 18 歳未満であった住民は、AUT（一次試験）を受けます。結節が検出された場合は、甲状腺疾患のガイドラインに従って、より詳細なTUE（確認検査）が行われ、必要に応じて穿刺吸引細胞診（FNAC）が行われます。^7,37,38。がんと診断された場合、患者は甲状腺疾患のガイドラインに従って腫瘍の外科的治療を受けます。^5.7。当初、甲状腺がん患者40人が登録されたが、脳腫瘍に対する放射線療法と化学療法の既往があるため1人が除外された。別の患者は、FP の外にいて、FP の AUT プログラムにリンクされていなかったため、除外されました。対照として、福島県立医科大学の20歳以上の健康な学生32名を登録したが、小児期に子宮頸腫瘍の手術歴があるため、CT検査の既往のある患者1名は除外された。

分析には 3 つのグループが含まれました: 甲状腺がんグループ (n = 38、男性 15 人、女性 23 人、年齢範囲 12 ～ 26 歳、年齢中央値 18 歳)、甲状腺に関連する疾患のグループ (非甲状腺がん) ( n = 30、男性 6 人、女性 24 人、年齢範囲 15 ～ 28 歳、年齢中央値 21 歳）と対照群（n = 31、男性 20 人、女性 11 人、年齢範囲 20 ～ 23 歳、年齢中央値 22 歳）年）。年）。甲状腺がん患者、甲状腺関連疾患（非甲状腺がん）患者、対照群の患者のサンプル採取前のCTスキャン数と検査部位をそれぞれ表1、表2、表3に示します。個人情報保護のため、これらの表には年齢情報は含まれていません。

PB からのリンパ球の分離と細胞培養条件

単核血球は、BD Vacutainer CPT チューブ (BD Biosciences、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) を製造者の指示に従って使用して、ヘパリン添加 PB から単離されました。細胞を、20％ウシ胎児血清（Equitech Bio、Keilor East、オーストラリア）、2％ phytohemagglutinin-HA15（Remel、Lenexa、KS、USA）を含むRPMI 1640培地（Nacalai Tesque、京都、日本）に懸濁し、60 15 mL Falcon チューブ内のカナマイシン溶液 (Life Technologies、米国カリフォルニア州カールズバッド) μg/mL。リンパ球は加湿5%CO2中で培養されました。₂ 37℃で48時間インキュベーター。最初に分裂した中期細胞は、培養物をコルセミド（最終濃度、０．０５μｇ／ｍＬ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で４８時間処理することによって得た。 18 歳未満のサンプルの場合、過剰な収縮を防ぐためにコルセミドを 24 時間以内に追加しました。

細胞採取

48 時間の培養後、標準的な細胞遺伝学手順に従って細胞を回収し、0.075 M KCL で処理し、メタノール/酢酸 (3:1) で固定しました。^15.39。最後に、細胞ペレットをペレットのサイズに応じて 1 ～ 2 ml の固定液に懸濁しました。懸濁液の 1 滴 (約 20 μL) をスライド上に置き、水浴上に広げました。

染色体のペイント

各スライドはまず 65°C で少なくとも 1 時間乾燥させて硬化させました。次に、カスタム XCP-Mix プローブソリューション (Mix-#1R-#2G-#4RG; MetaSystems、Altlussheim、Germany) 6 ～ 7 µL を 22 × 22 mm の領域ごとに塗布し、スライドをガラスで覆いました。カバースリップを貼り、ボンド紙で密封します。その後の操作は製造業者の指示に従って実施した。スライドを75℃のホットプレート上で2分間インキュベートすることによって核DNAを変性させ、続いて加湿チャンバー内で37℃で一晩インキュベートしてハイブリダイゼーションを可能にした。ガラス製カバースリップを取り外し、スライドを 0.4 × SSC で 72 °C で 2 分間洗浄しました。排水後、スライドを 2 × SSC/0.05% Tween-20 中で室温 (RT) で 30 秒間洗浄しました。次に、結晶の形成を防ぐためにスライドを蒸留水で簡単にすすぎ、室温で風乾しました。最後に、核を DAPI を含む Vectashield 封入剤 (Vector、バーリンゲーム、米国) で対比染色し、スライドをカバーガラスで覆い、マニキュアで密封しました。

染色体異常の画像キャプチャとスコアリング (染色体 1、2、4 の描画)

染色体の調製直後に、CCD カメラと Metafer 4 ソフトウェア (MetaSystems GmbH、アルトラッスハイム、ドイツ) を備えた 2 セットの AXIO Imager Z2 顕微鏡 (Carl Zeiss AG、オーバーコッヘン、ドイツ) を使用して、AutoCapt モードで FISH 画像をキャプチャしました。中期細胞は手動モードでスコアリングするために選択されました。染色体分析は、国際原子力機関(IAEA)のマニュアル(IAEA 2001)に従って実施した。³⁹ 被験者の背景についての情報を知らされていない、訓練を受けた経験豊富な観察者によって行われます。

以前の研究では、ギムザ染色とセントロメア-FISHを使用してDic形成を分析し、患者あたり2,000の中期を分析しました。^17、18.19。したがって、Dic 解析と Tr 解析の間で解析した細胞数を一致させるために、約 5,000 個の細胞を解析しましたが、これはほぼ 2,000 個の細胞の全ゲノム解析に相当します (それぞれ表 1、2、および 3)。

約 44 ～ 46 個の染色体を持つ中期図のみが染色体分析用に選択されました。いくつかのクローン染色体異常が疑われたが、それに応じて Tr 数を修正しなかった。したがって、3 つの異なるペイントで染色された 3 対の染色体 (1、2、および 4) を持つ細胞が分析のために選択されました。四倍性を示す中期細胞は分析から除外した。転座した染色体パートナーが見つからなかった場合、それは一方向性 (非相互的) であると考えられました。パートナーが見つかった場合は、双方向（相互）としてカウントされます。どちらの場合も、これは転座した染色体としてカウントされました。複雑な染色体異常の場合、転座数はカラージャンクションの数に基づいて決定されました (NCJ)⁴⁰。たとえば、1 または 2 の NCJ は 1 つの転座を示し、3 または 4 の NCJ は 2 つの転座を示し、5 または 6 の NCJ は 3 つの転座を示します。

スコアリングでは、ゲノム全体の転座の頻度を計算するために使用される式 (F_g) は、検出された転座に 3 つの色 (染色体 1、赤、染色体 2、緑、染色体 4、黄色) を使用した次の式に基づいていました。

$$ {\text{F}}_{{\text{G}}} = {\text{ F}}_{{{\text{P}}({1} + {2} + {4}) }} /{ 2}.0{5 }\left[ {{\text{f}}_{{1}} \left( {{1}{-}{\text{f}}_{{1}} } \right) + {\text{f}}_{{2}} \left( {{1}{-}{\text{f}}_{{2}} } \right) + {\text{f}}_{{4}} \left( {{1}{-}{\text{f}}_{{4}} } \right) \, {-} \, \left( {{\text{f}}_{{1}} {\text{f}}_{{2}} + {\text{f}}_{{1}} {\text{f}}_{{4}} + {\text{f}}_{{2}} {\text{f}}_{{4}} } \right)} \right] $$

F_g: ゲノム異常の完全な頻度、 F_p: FISH によって検出された転座頻度、 F_p: 被験者の性別を考慮した、ハイブリダイズしたゲノムの割合 (女性: F_p= 0.2234、男性: F_p= 0.2271)。

ゲノムの中で染色体 1、2、4 が占める割合は約 23% です。したがって、F_g は次の式で求められます。

$$ \begin{gathered} {\text{F}}_{{\text{G}}} = {\text{ F}}_{{\text{P}}} \times {2}。 {567 }\left( {{\text{女性}}} \right) \hfill \\ {\text{F}}_{{\text{G}}} = {\text{ F}}_{{ \text{P}}} \times {2}。 {533 }\left( {{\text{男性}}} \right) \hfill \\ \end{集まった} $$

解析の細胞数を統一するために、F を決定しました。_g それぞれ女性と男性について上記の式に従って得られた 2000 個のセルに相当する値に従っています。さらに、年齢調整された Tr 頻度は、Sigurdson らの方法に基づいて決定されました。⁴¹。

統計分析

まず、CT検査歴の有無および男女間における年齢調整Tra異常頻度の差異を、Studentのt検定を用いて分析した。次に、甲状腺がん、甲状腺関連疾患（非甲状腺がん）患者、および対照患者における年齢調整した Tra 異常頻度の差異を、ANOVA を使用してテストしました。 ANOVA 検定が有意な場合は、Tukey 検定を使用してグループ間の差異を比較しました。 CT 歴は年齢調整 Tr 頻度に影響を与えるため、CT 歴のある個人間でのみ同じ比較を実行しました。さらに、甲状腺がん、甲状腺関連疾患（非甲状腺がん）患者、および対照患者における年齢調整したTr異常頻度の差を、性別およびCT検査歴による調整後、ANCOVAによって比較した。 SAS バージョン 9.4 (SAS Institute、米国ノースカロライナ州ケアリー) をすべての統計分析に使用し、統計検定には両側確率値を使用しました。 p. 0.05 未満の値は統計的に有意であるとみなされます。